一、外周血样本
　　

1. 单细胞悬液制备实验原理

　　PBMC(peripheral blood mononuclear cell)，外周血单个核细胞，其主要细胞类型为血液中具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞(T细胞、B细胞)，单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。

　　Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底;淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
　　

2.单细胞悬液制备实验材料

　　全血 (以10ml为例)

　　无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水

　　蔗糖溶液(Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)

　　RPMI 1640培养基 (Invitrogen)

　　胎牛血清(FBS)(GIBCO)

　　双抗P/S (Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)

　　二甲亚砜(DMSO)(SIGMA)

　　预先装好异丙醇的冻存盒

3.单细胞悬液制备操作步骤

　　1.配制所需的溶液：

　　a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S;

　　b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO;

　　2.将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀;

　　3.取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液;

　　4.2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层;

　

　　5.PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。

　　6.加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗;

　　7.加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板;

　　8.细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放入冻存盒(冻存盒可事先在4℃冰箱预冷)。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。

　　备注：

　　(1)全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是需要保证两种溶液分层清晰。

　　(2)分离PBMC在离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。

　　二、脱落细胞样本

　　在临床工作中，可以收集到大量自然脱落细胞，这些细胞标本经过简单处理，便可成为较好的单细胞悬液制备供流式细胞术分析。主要包括脱落细胞、胸腹水细胞、尿液、内镜刷检细胞等。

　　(一)食管拉网细胞的单细胞悬液的制备

　　1.将食管拉网器上的细胞洗脱到20ml PBS液中，以1500r/min离心后，再用PBS液洗2次，离心500~800r/min，1~2min，弃上清;

　　2.再加入PBS液5ml，以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清;

　　3.加少许PBS液混匀沉淀细胞，加固定液或低温保存，备用。

　　(二)尿液脱落细胞的单细胞悬液的制备

　　1.用以清洁器皿收集24h尿液，置4℃冰箱中自然沉淀2h，轻轻倒去上清液，留下少许带细胞的沉淀物，用吸管移至10~20ml离心管中;

　　2.500r/min离心10min，去上清;

　　3.加PBS液8~10ml，以1000r/min离心10min，去上清，重复再洗1次;

　　4.再加5ml PBS液混匀，用300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清;

　　5.再加少许PBS液，混匀。加固定液或低温保存，备用。

　　(三)胸、腹水脱落细胞的制备

　　1.抽取胸、腹水50~100ml，加入1000U/ml肝素液1ml，放盐水瓶中置于4℃冰箱中静置6~12h，弃去上清;

　　2.将底部10~20ml用长吸管移入试管中，用PBS液洗3次，以1500r/min离心沉淀5min;

　　3.再加5ml PBS液混匀，用300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清;

　　4.加少许PBS液，混匀;加固定液或低温保存，备用。

　　(四)冲洗液细胞样品的制备

　　1.用300~500ml生理盐水冲洗膀胱，冲洗一定时间后，吸出冲洗液放入容器中于冰箱内置6~12h;

　　2.取沉淀液20~40ml，离心沉淀并以生理盐水洗2次，吸上清;

　　3.加10ml PBS液，混匀，以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清;

　　4.过滤后1000r/min，10min，离心沉淀，去上清;加固定液或低温保存备用。