单细胞转录组测序技术原理-上海净信

　　单细胞测序主要涉及单细胞基因组测序和转录组测序两个方面，分别针对单细胞DNA及RNA进行序列分析和比较。单细胞测序一直是科学家关注的一个热点。单细胞基因组测序目前主要有两种扩增方法：MALBAC方法及MDA方法，而单细胞转录组目前主要有三种方法：SMART扩增技术、10×genomics技术及Andeplete技术。

　　今天主要和大家聊聊单细胞转录组测序。要实现单细胞转录组测序，需要解决2个难题：

　　1.PCR偏差：单个细胞含有约10pg total RNA，而约80%以上信息为rRNA，从单细胞RNA到文库意味着核酸的扩增量要达到百万倍以上。而在这个高的扩增量不引入PCR偏差一直是个较大的问题。我们可以想一下，如果两个样本基因表达量是相同的，但扩增效率A是99%，B是97%，在扩增30个循环后，两者在扩增后的表达就有了1.84(0.99^30/0.97^30)倍的差异。而当我们分析差异基因的时候如果选1.5倍作为差异基因的标准，那么本来没有差异的基因也会出现差异。

　　2.去除rRNA：rRNA(核糖体RNA)在total RNA占比一般在80%以上，如果不加区分地进行逆转录，再扩增、建库很可能测序得到的绝大部分序列都是rRNA的序列，但是一般情况下，如果你更关心mRNA等编码基因的序列，rRNA序列不能给我们带来有效的信息，可以说它是无用的。

下面我们来分别介绍单细胞转录组测序的三个扩增技术：

　　SMART扩增技术：

　　SMART扩增技术最核心的技术，就是设计了2个特殊的引物。再配合用MMLV逆转录酶进行逆转录。

　　特殊引物1由中间PolyT序列加上一段通用序列及3’末端两个简并碱基构成，但在PolyT的3’端倒数第二个碱基是A、C、G而非T的简并碱基，而倒数第一个为简并碱基，这样做的好处是让它正好结合在mRNA的3’端连到Poly(A)尾巴的这个连接处，而不会结合到mRNA的别的地方。这样就保证了逆转录的起始位置正好是mRNA的3’端的序列终止位置。MMLV逆转录酶，这个酶有个特点，就是它在转录到mRNA的5’端末端的时侯，单细胞转录组测序，会在新合成的cDNA的3’末端，多加出几个C碱基来。

　　特殊引物2由一段通用序列及它的3’端是3个非脱氧的G碱基构成，也就是核糖核酸的、RNA的G碱基，而不是DNA的G碱基，这个引物可以与刚才新合成的cDNA的3’端的那几个C碱基发生互补杂交，单细胞转录组测序，然后引导这个MMLV酶再次发挥聚合作用，以刚才那条新合成的cDNA为模板，复制的结果，就是得到双链的cDNA。

　　这个双链cDNA，两端都已经接好了我们人工设计的PCR引物序列，然后，就加入常规的PCR引物，进行常规的PCR扩增，常规PCR扩增，得到大量DNA。然后可以象常规的DNA建库那样，超声打断、建库、上机测序了。

　　通过SMART技术得到的主要是mRNA信息，LncRNA信息大部分会丢失，SMART技术对于RNA的质量要求较高，如果RNA出现降解会导致mRNA 5’端信息丢失。通用引物技术能保证扩增的均一性，但PCR引入的突变不能够分析出来单细胞转录组测序。

　　10×genomics技术：

　　首先再凝胶微珠上种上特定的DNA片段，DNA片段由三部分组成：Barcode、UMI、PolyT组成。Barcode是16个碱基的长度。一共有400万种Barcode，一个微珠是对应于一种Barcode，通过这400万种Barcode，可以把凝胶微珠给区分开。UMI是一段随机序列，也就是说每一个DNA分子，都有自己的UMI序列。10个碱基长的UMI，有100万种序列的变化(4^10 = 1,048,576)，UMI的作用是为了区分哪些哪些reads是来自于一个原始cDNA分子，区分基因片段重复还是duplication及区分是真实的SNP位点还是PCR产生的突变。

　　通过10×genomics仪器将单个细胞与单个凝胶微珠通过油相混在一起，形成油包水的小微滴，接下来把细胞膜破掉，单细胞转录组测序让细胞当中的mRNA游离出来。游离出来的mRNA与小液滴中的水相混合，也就是和逆转录酶、结合在凝胶微珠上的核酸引物、以及dNTP底物相接触。

　　接着，发生逆转录反应。mRNA与凝胶微珠上带标签的DNA分子相结合，在逆转录酶的作用下，逆转录出cDNA来。把这个乳浊液当中所有的水相抽出来，也就是把所有带了标签的cDNA分子都抽出来，再把这些cDNA分子都加上接头，经过PCR扩增，做成illumina的测序文库，放到Illumina的测序仪上进行测序。测序完成之后，进行数据分析。

　　10×genomics技术一次可以同时得到大量大细胞数据，但只能得到mRNA信息，LncRNA大部分信息丢失，UMI技术能很好去除认为分析引入duplication及PCR引入SNP位点。同样对RNA质量要求高，降解同样会引起5’端信息丢失。

　　Anydeplete 技术：

　　Anydeplete技术首先通过随机引物进行一链合成，一链合成引入核苷酸类似物，用于酶切打断，二链合成同样引入核苷酸类似物用于保证链特异性。然后两端加上接头，接头一条链也带有核苷酸类似物，用于酶切降解。当形成单链文库后，设计特异性引物与rRNA形成文库结合，一轮退货延伸，rRNA文库形成双链结构。Reverse adaptor上带有特异的酶切位点，当形成双链结构酶切位点被识别，切去接头，这样rRNA形成的文库不带有完整的接头，而其他文库带有完整接头，通过PCR扩增富积既能得到想要的信息，包含mRNA及LncRNA信息。同样Anydeplete技术与10×genomics技术单细胞转录组测序一样，包含分子标签，可分析duplication及PCR产生突变位点。

　　Anydeplete技术能够用于降解性样本，保证5’端及3’端信息的完整，能同时得到mRNA及LncRNA信息，如果只希望得到mRNA信息，Anydeplete技术则会引起一部分数据浪费。

　　总结： SMART技术可用于单细胞mRNA测序，对RNA质量要求高，RNA降解会引起5’端信息丢失，没有分子标签功能。 10×genomics技术可用于单细胞mRNA测序，对RNA质量要求高，RNA降解会引起5’端信息丢失，有分子标签功能。 Anydeplete技术可用于单细胞mRNA及LncRNA测序，对RNA质量要求不高，可用于降解性样本单细胞转录组测序。

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