1. 为什么要做单细胞RNA测序(ScRNA-seq)?
主要解决的问题主要有两个：一是异质性(heterogeneity)，比如a)鉴定某些因为含量(比例)较低而在常规RNA测序检测时被“掩盖”的细胞亚群;b) 检测细胞群体中不同的个体细胞：比如表达不同TCR的T细胞，胚胎发育早期的各个细胞等;c)追踪某群细胞内细胞间的谱系(lineage)或发育关系;二是获得基因表达、剪接等信息以及根据这些信息构建的调控关系。
2. 做单细胞测序的基本步骤是什么?
如上图所示，共分为9个步骤：
1)单细胞分离;
2) 保留mRNA的细胞裂解;
3) mRNA捕获;
4)RNA反转成cDNA;
5)cDNA扩增;
6)cDNA测序文库制备;
7)序列文库混样(pooling);
8)生物信息学工具进行质控;
9)专业的工具进行分析和结果展示;
3. 单细胞测序检测的样品类型有哪些?
理论上说，任何的真核细胞都可以进行scRNA-seq检测。但在实际操作过程中，需要注意的是：1)从组织(特别是实体组织)中获得细胞的数量和活性;2) 在获取过程中人为操作对细胞转录组的影响，以避免出现人为因素的转录表达变化。当然从技术上说，除了分离单个细胞进行检测外，还可以直接分离细胞核(nuclei)进行测序。
4. 单细胞测序的方法选择?
总体上有大约20种protocol，各个protocol的比较如下图所示：
我们可以看到转录本的长度包括了：全长(Full length)和3’端测序，需要注意的是对于表达量较低的RNA来说更推荐全长测序。其它的信息还包括了测序的平台(Droplet、Nanowell等)、测序通量(细胞的数量)、测序深度、反应体系和参考文献等。
另外，在评估技术差异的时候常用的两种策略是“Spike-in”和“UMI”，两者的定义：
Spike-in：A molecule or a set of molecules introduced to the sample in order to calibrate measurements and account for technical variation; commonly used examples include external RNA control consortium (ERCC) controls (Ambion/Thermo Fisher Scientific) and Spike-in RNA variant control mixes (SIRVs, Lexogen);
UMI(Unique molecular identifier) :A variation of barcoding, in which the RNA molecules to be amplified are tagged with random n-mer oligonucleotides. The number of distinct tags is designed to significantly exceed the number of copies of each transcript species to be amplified, resulting in uniquely tagged molecules, and allowing control for amplification biases.
5. 需要测定的细胞数量以及测序深度该如何确定?
总体上说，大家需要考虑的因素包括研究目的、细胞的异质性大小、平台和价格。一般来说，异质性越高，我们需要检测的细胞亚群比例越低，需要测定的细胞数量就越多，大家可以类比考虑，比如A袋子有5个红球、5个蓝球组成;B袋子有赤橙黄绿青蓝紫7个颜色组成的10个球，其中我们关心的蓝球只有1个，如果我们想抽到篮球，是不是要抽更多次B袋子?
6. 单细胞RNA测序与常规RNA测序的区别是什么?
主要有三点：
1) 单细胞测序中某些低风度的转录本不能被检测到;
2)单细胞测序比常规测序的会有更高的技术误差(包括检测噪音等);
3)单细胞测序检测的转录本量的分布上更加复杂，一般是符合负二项分布的，但也出现其它的分布，因此在选择统计方法时一定要特别注意。
7. 单细胞RNA测序的分析该如何做?
这一部分我们下次单独写一期文章来介绍。
8. 单细胞RNA测序未来5年的前景如何?
主要包括几点：
1) 对检测细胞(样本)的要求降低：从新鲜细胞到冷冻保存的细胞;
2)性价比的提高：包括了平台技术的进步导致价格进一步降低和检测通量的增加：
3)对低丰度RNA检测的问题;
4)新的生信工具和软件的出现：后面我们会为大家介绍一个数据库——SCPortalen，来看别人的单细胞测序技术数据的挖掘使用。
5)与其它技术的联合：比如Crispr;
6)临床应用：按照这篇文章的观点，单细胞测序往临床上用的时间点大约在5年。
9. 单细胞RNA测序在病毒学上的应用?
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