单细胞测序技术及其在传染病研究领域中的应用-上海净信

　　同一组织中的细胞往往被认为是具有相同状态的功能单位，因此传统的测序技术分析的是细胞群体的总体平均反应。然而由于细胞存在异质性，即使是来自同一细胞系或者相同细胞，由于基因组和表观基因组的重编程(reprogramming)、DNA复制错误等会产生不同的基因组、转录组和表观基因组。而单细胞测序技术(single-cell sequencing，SCS)可以检测单个细胞DNA水平的单核苷酸变异(single nucleotide variations，SNVs)、拷贝数变化(copy number variatons，CNVs)和基因组结构的变化，还可以检测单个细胞RNA水平的基因表达、基因融合和选择性剪切等，以及DNA甲基化、组蛋白修饰等。近十年来，单细胞测序技术得到了迅猛的发展，已经应用在医学、微生物学和免疫学等多个领域。本文将对单细胞测序技术的方法和应用进行总结，并对其在传染病研究中的应用进行介绍。

　　单细胞测序技术的方法

　　随着测序技术的不断创新，对细胞分子的研究逐渐从细胞群体发展到单个细胞样本。早期使用低通量的免疫荧光、单细胞PCR(single-cell PCR)和单细胞实时PCR等技术检测单细胞的分子标记。下一代测序(next generation sequencing，NGS)技术的发展为实现单细胞测序技术提供了新的可能。2009 年Tang等采用mRNA全转录组测序法对小鼠单个四细胞期胚胎的卵裂球转录组进行了单细胞水平分析。单细胞测序工作已经迅速扩展到整个基因组序列。

　　单细胞测序主要包括单细胞DNA测序、RNA测序和表观基因组测序，这三种测序类型可以从不同角度揭示细胞各个阶段的功能和特点。其中表观基因组测序可以揭示DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质可及性、蛋白质-DNA相互作用和染色体的空间结构)等不同方面的基因调控。

　　单细胞测序主要包括以下4个步骤：单细胞分离，核酸序列扩增，基因测序和数据分析。其中单细胞分离方法和核酸序列扩增策略是实现单细胞测序的核心技术。

　　单细胞分离

　　显微操作法(micromanipulation)是比较普遍的直视分选细胞技术，成本低廉，但是通量低，需要投入大量人力，并且容易对细胞造成机械性损伤，不利于规模化应用。而激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection，LCM)可以快速获取单个细胞，但是成本较高、通量低，并且该方法容易导致染色体片段丢失，还经常造成RNA降解。

　　目前常用的单细胞分离技术是荧光激活细胞分选(fl uorescence-activated cell sorting，F ACS)。该方法与前述方法不同，可以高通量、自动化地分离单个细胞，是目前应用最多的单细胞分离技术。该方法通过细胞的物理特性(如细胞大小、荧光散射度)和特异性的分子标记对靶细胞进行识别和分离。FACS法需要大量的细胞悬液，并且该方法检测的荧光信号强度有限，因此不适用于分选低丰度的细胞。

　　近几年发展的微流控技术(microfl uidics)利用微流控芯片上的微管道进行多种单细胞分选。该方法需要的样本量较少，试剂损耗低，细胞污染率低，可以进行规模化的推广和应用。因此，微流控技术是目前最理想的单细胞分离方法，具有广阔的应用前景。

　　核酸序列扩增

　　与常规的群体细胞提取的核酸不同，单个细胞所含的DNA或RNA的含量仅为皮克水平，远远低于任何测序技术所需的核酸量。因此通过全基因组扩增(whole-genome amplifi cation，WGA) 和全转录组扩增(whole-transcriptome amplifi cation，WTA)，获取高保真、无偏向性的足量DNA或RNA就成为单细胞测序的关键环节。

　　全基因组扩增

　　在NGS技术之前，单细胞基因组扩增多是基于PCR法，如连接锚定PCR(l igation-anchored PCR，LA-PCR)、引物延伸与扩增PCR(p rimer extension pre-amplifi cation PCR，PEP-PCR)和简并寡核苷酸引物PCR(d egeneration oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR)。这些方法都存在扩增效率低，且会产生非特异性扩增的问题。基于等温反应的多重置换法(multiple displacement amplifi cation，MDA)是常用的全基因组扩增技术。MDA技术主要使用φ29DNA聚合酶，在恒温下对DNA进行高效的指数扩增，获得高保真、均一完整的全基因组序列。但是MDA技术会产生显著的非特异性扩增。而多重退火环状循环扩增法(multiple annealing and looping-based amplifi cation cycles，MALBAC)则采用线性扩增方式，可获得一致性好、偏倚少的全基因组DNA，显著提高单细胞测序的精确度。MALBAC的扩增效率相对MDA较低，也会产生较高的假阳性率。

　　Stepanauskas等提出了一种组合MDA和FACS并改进的方法，即WGA-X。该方法增强了单个微生物细胞和病毒颗粒的基因组回收效率，同时保持了易用性和可扩展性，因此可以从未培养的微生物细胞和环境样品中的病毒颗粒中获得基因组序列和细胞大小信息。

　　全转录组扩增

　　单细胞转录组扩增的方法主要有唐氏法(Tang’s method)、Smart-seq、Smart-seq2、Quarz-seq、线性扩法(c ell expression by liner amplification and sequencing，CEL-seq)，单细胞标记的逆转录(s ingle-cell tagged reverse-transcription，STRT)和定量的单细胞RNA测序(q uantitative single-cell RNA-seq)等。其中Smart-seq 和Smart-seq2 通过模板转换技术，能够获得全长的RNA，不仅可以检测基因表达情况，还可以研究单个细胞的选择性剪切，鉴定新的转录本。

　　单细胞测序技术的应用

　　随着单细胞测序技术的迅速发展，该技术已经被应用在多个领域，如用于研究肿瘤的发生和演变、对肿瘤临床检测等。利用单细胞测序技术可以定量分析实体瘤和循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)的异质性，检测有重要作用的罕见细胞，发现克隆演变(clonal evolution)等。因此，可以利用该技术预测和监控治疗效果和预后情况、监测疾病进展、检测耐药等，实现个体化精准医疗。例如Tirosh等利用单细胞RNA测序技术分析了4645 个转移性黑色素瘤细胞的肿瘤内异质性、肿瘤细胞分期和肿瘤微环境等。而Lohr等从多发性骨髓瘤病人中分离到335个肿瘤细胞，利用DNA测序技术监测治疗效果和基因突变。

　　此外，单细胞测序技术还应用在胚胎学、免疫学、微生物学等多个方面，如病原微生物检测、传染病诊断、宿主免疫应答、抗体筛选等等。下文将主要介绍单细胞测序技术在传染病研究领域的应用。

　　单细胞测序技术在传染病研究领域的应用

　　利用单细胞测序技术，可以研究单细胞水平上病原微生物和宿主细胞的基因组或转录组。通过分析病原微生物的核酸序列，可以检测和鉴定新的微生物物种，了解微生物的分子进化机制，研究病毒感染的动力学;而通过分析宿主细胞转录组，可以探讨细胞异质性对病毒生命周期的影响，以及病毒引起的宿主免疫应答。

　　在微生物检测进化及传染病诊断方面的应用

　　单细胞测序技术之前，由于很多微生物难以培养，科学家们无法破译其基因组结构。微生物的单细胞测序技术可用于研究未培养微生物的代谢潜力、相互作用和进化情况，发现新的微生物物种，大大促进人类微生物组计划的发展。利用单细胞测序技术不仅可以检测未知的病原微生物，还可以监测到耐药株的出现，跟踪病原体的抗性，从而进行传染病的诊断。单细胞基因组学在传染病领域得到了广泛的应用，如单个细胞中的病毒感染动力学，病原体的抗性和传播跟踪，靶向或非靶向的病原基因组的恢复，致病新病原菌鉴定等。

　　鉴于细胞异质性的存在，在单细胞水平上理解病毒的遗传结构是至关重要的。Combe等对水泡性口炎病毒感染的90个单细胞的881个病毒斑进行测序，发现单个感染单元内存在多个基因差异的病毒基因组。Guo等开发了一种基于微流控技术的高通量平台，用于分析单细胞中病毒感染的动力学。他们已研究了达千个脊髓灰质炎病毒感染的单个细胞，分析了其病毒感染的动力学，发现抗病毒药物可以选择性地消灭病毒种群中的成员。这促进了毒力因子的发现和特性鉴定，阐明了病毒种群逃避药物的作用机制。Yang 等]调查了乙肝病毒感染情况，并在单细胞水平上量化了胞内病毒核酸的数量，即细胞质vRNA和vDNA，以及核共价封闭的环状DNA(covalently-closed circular DNAs，cccDNAs)。

　　利用单细胞测序技术不仅可以精细化识别微生物基因组变异，进行病原微生物进化及溯源研究，还可以在单细胞水平上研究病毒感染的动力学，定义病原微生物的代谢特征、致病潜力和耐药性，进行疾病诊断。这有助于阐明病原微生物与宿主之间的相互作用机制，会对传染病防控和人类健康领域带来重要影响。

　　在宿主免疫应答方面的应用

　　宿主对病原微生物的免疫应答研究通常是针对群体细胞。然而，这种群体细胞研究难以区分大细胞群体的弱反应和小细胞群体的强反应;即使同源细胞也存在功能上的异质性。单细胞测序技术可以获得宿主应答的内在异质性，精准评估免疫细胞被激活的分子机制。目前单细胞测序技术已经应用在鉴定罕见的T细胞，分析细胞黏附分子，研究固有淋巴细胞的异质性，筛选中和性抗体等。Holt等利用单细胞测序技术鉴定了罕见的CD4阳性的T细胞。Yu 等利用单细胞RNA测序技术对小鼠骨髓祖细胞进行分析，发现了固有淋巴细胞ILC2发育早期的免疫检查点PD-1hiIL-25Rhi，从新的角度剖析PD-1和PD-L1在免疫治疗中的作用。Tanaka等[33]针对人类T淋巴细胞白血病病毒1 型(human T-cell lymphotropic virus type 1，HTLV-1)特异的CTL细胞的T细胞受体库进行单细胞测序，发现移植前后骨髓和外周血CTL细胞的寡克隆多样性受到高度限制。

　　在抗体筛选中的应用

　　目前大规模筛选抗体的方法主要是通过噬菌体、酵母等抗体文库。所获取的抗体存在一定的弊端：抗体是重链和轻链的随机配对，掩盖了自然的体液免疫反应;需要进行大量的实验;筛选出的中和抗体往往只具有有限的中和功能。

　　而单细胞测序技术给抗体筛选带来了重大变革。利用该技术可以从病人外周血淋巴细胞中获得抗原特异性的单个记忆性B细胞，并针对单个细胞的抗体的重链和轻链进行RT-PCR，从而获得人源的单克隆抗体。单个 B细胞测序技术可以快速、高效地分离鉴定出抗原特异性的中和抗体，具有广阔的应用前景。

　　目前，利用单个B细胞测序技术已经筛选和鉴定出多种病毒的中和抗体。Scheid等利用FACS法从感染艾滋病毒的患者中分离到对HIV抗原有亲和力的记忆性B细胞，并从中筛选到大量的HIV-1特异性的中和抗体。Tsioris等通过单细胞测序技术从人B细胞中鉴定出针对西尼罗河病毒的中和抗体。Wang等从中国寨卡康复病人体内鉴定出高效、特异的寨卡病毒单克隆抗体。该抗体能在小鼠模型上有效治疗寨卡病毒感染，有望成为治疗寨卡病毒感染的候选药物。类似地，Cox 等从人抗原特异性记忆B细胞中筛选到登革病毒的中和抗体。

　　单细胞测序技术的出现是生物学领域的一个里程碑。经过近几年的发展，该技术已经大量应用在肿瘤研究、临床检测、免疫应答、抗体筛选和微生物鉴定等各个领域。该技术不仅可以对未培养的病原微生物直接测序，还可以快速、高效地筛选出抗原特异的人源中和抗体，以应对新发和突发的传染性疾病。

　　但是该技术仍处在不断完善和发展的阶段，还存在以下方面亟需改进：①在前期细胞样本的采集和保存阶段，务必要保证细胞样本新鲜，或者加入有效的保护剂;②单细胞分选时还可能存在细胞交叉污染、细胞损伤等问题，期望未来微流控芯片技术能够不断改进，大大提高单细胞分选的效率;③DNA或RNA扩增中仍然存在扩增失败，或者产生很多非特异性产物情况，需要严格控制实验条件，同时也期待扩增技术的不断改进。此外，使用单细胞测序技术的成本仍然很高，影响了其在临床检测的应用和推广。

　　随着单细胞多组学测序技术(single-cell multiomics sequencing)的发展，未来有望利用该技术在单细胞水平进行基因组、转录组、表观基因组和蛋白质组等多种组学的综合研究，从而更加系统全面地分析单个细胞、细菌或病毒的功能，进而实现精准医疗，加强传染病防控。

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